Psi genom III - genetyczny odcisk palca

Awatar użytkownika
1e2w3a
Posty: 2294
Rejestracja: wtorek 28 wrz 2010, 21:07
Gadu-Gadu: 0
Lokalizacja: MIĘDZYBÓRZ / WROCŁAW, Dolny Śląsk
Kontakt:

Psi genom III - genetyczny odcisk palca

Post autor: 1e2w3a » sobota 04 sty 2020, 12:30

Struktura genomu, sekwencje mikrosatelitarne.

Jak wiadomo linie papilarne tworzą niepowtarzalny i niezmienny układ bruzd na skórze. Jest to cecha fenotypowa przypisana konkretnemu osobnikowi, wykorzystywana w procesie ustalania tożsamości. Ale również w genotypie (człowieka, psa, innych ssaków) zawarta jest informacja, również niepowtarzalna, niezmienna i jednoznaczna, która może być przypisana tylko konkretnemu osobnikowi. Jest możliwa do odtworzenia z różnych tkanek (ale tylko z takich w których komórki zawierają jądra), również po jego śmierci. Taka informacja nazywana jest często „genetycznym odciskiem palca” (DNA fingerprinting) lub profilem DNA. Takie testy DNA (w przypadku psów) służą tylko do potwierdzenia lub zaprzeczenia pochodzenia psa. Oczywiście aby to zbadać należy określić nie tylko profil DNA konkretnego psa ale też profile jego rodziców, czy rodzeństwa albo dalszych kuzynów no bo takie profile potem muszą być z soba porównane.

Profile DNA (genetyczne odciski palców) nie udzielają żadnych informacji na temat genetycznych wad i chorób, nosicielstwa, koloru oczu, umaszczenia, wielkości, psychiki, itp. Te bowiem cechy zależą od informacji zawartej w genach (czyli części informacyjnej DNA) a informacje przypisane tożsamości (profilowi DNA) znajdują się w części poza genowej, która nie zawiera informacji zdolnej do odczytania przez enzymy i nie warunkuje tych wcześniej wymienionych cech.

Genom psa już został zsekwencjonowany (i to pewnie nie jednego) ale do badań porównawczych nie są potrzebne całe genomy, wystarczą tylko pewne sekwencje tandemowo (ułożone jeden obok drugiego) powtarzające się w genomie, zwane sekwencjami mikrosatelitararnymi. Używa się też określeń STR (short tandem repeats), mikrosatelita czy marker. Marker DNA to konkretny odcinek DNA (o znanej sekwencji nukleotydów),którego położenie w chromosomie (locus) jest znane. W naszym przypadku będą to markery odpowiadające sekwencjom mikrosatelitarnym.

Jakie sekwencje i genomie można wyróżnić? Główny podział to podział na część informacyjną i nieinformacyjną. Najważniejsze oczywiście są te które mają zakodowaną informację ale i te z których niczego nie można odczytać też nie są bez znaczenia, przynajmniej niektóre. I tak:
Geny to sekwencje kodujące informacje o jakimś produkcie (o jakimś białku). Mogą występować w licznych lub mniej licznych kopiach lub pojedynczo. Mogą też mieć różną długość (ciąg sekwencji nukleotydów). Jeden gen może mieć jedną lub kilka wersji z których każda dobrze funkcjonuje i jest w stanie „wyprodukować” zakodowane białko. Znajdują się na różnych chromosomach w genomie a ich położenie na nim określa się locus (l. mn. to loci). To od nich zależy nasz wygląd, zdrowie, psychika, charakter, predyspozycje. Są bardziej konserwatywne niż sekwencje poza genowe niekodujące, tzn. podlegają mutacjom tylko w niewielkim stopniu.
Sekwencje związane z genami to przede wszystkim tzw. promotory (startery położone przed początkiem danego genu) i sekwencje regulatorowe (położone i miejscach bardziej odległych). To one zapoczątkowują odczyt informacji i ją regulują. Nie zawierają wprawdzie, tak jak geny, informacji o ciągu aminokwasów w białku ale ich funkcja jest znacząca. Niekorzystna mutacja w takich obszarach spowoduje, że pomimo właściwej sekwencji w genie, informacja nie zostanie odczytana i produkt (jakieś białko) nie powstanie.
Pseudogeny to zmutowane wersje genów, które już nie mogą spełniać swojej funkcji „produkowania” biologicznie aktywnego białka. Ich sekwencje mogą przypominać jakieś sekwencje genowe ale są one nie do odczytania.
Pozagenowy DNA to ta nieinformacyjna część genomu która stanowi w przypadku psa ok. 70 % jego całości. Część tych sekwencji jest unikatowa, część występuje w małej liczbie kopii. Jeszcze inne części stanowią umiarkowane lub wielokrotne powtórzenia które mogą być rozproszone po całym genomie lub uszeregowane w długie tandemowe ciągi powtórzeń. I te właśnie powtarzające się tandemowo regiony będą przedmiotem naszego zainteresowania bo to dzięki nim możliwa jest identyfikacja osobników i szukanie pokrewieństwa między nimi. Do tego celu można wykorzystać sekwencje minisatelitarne określane tez jako VNTR (variable number tandem repeats) lub mikrosatelity STR. Na tych ostatnich się skupimy gdyż to one obecnie są wykorzystywane do sporządzania profili DNA.
Jest jeszcze wiele ciekawych sekwencji w genomie ale poprzestanę na tych wymienionych powyżej. Dla naszych rozważań głównie będą potrzebne mikrosatelity.
Przykłady zapisu takich tandemowych sekwencji :

1. (AGAT)n ,
2. (AGC)nTGT(AGC)m,
3. (AT)n(GC)m(AT)p

gdzie :
m,n,p – liczba kopii, czyli tandemowych powtórzeń
(AGAT), (AGC), (AT), (GC) – sekwencje podstawowe, tzw. motywy powtórzeń
TGT – wstawka (bez powtorzeń)
A, G, T, C – oznaczenia nukleotydów
W przypadku 1. mamy n-krotne powtórzenie jednego motywu. W przypadku 2. powtórzenia motywu n-krotne i m-krotne są rozdzielone wstawką. W przypadku 3. występują 3 różne motywy.

Rozpiszmy przypadek 2. Niech n=2, m=3.
……………..AGCAGCTGTAGCAGCAGC………………………...

W następnej części będzie o polimorfiźmie sekwencji mikrosatelitarnych STR.

CDN


SOKOŁÓWKA

Zapraszam na stronę o moich ogarach : http://www.mojeogary.ga

Awatar użytkownika
1e2w3a
Posty: 2294
Rejestracja: wtorek 28 wrz 2010, 21:07
Gadu-Gadu: 0
Lokalizacja: MIĘDZYBÓRZ / WROCŁAW, Dolny Śląsk
Kontakt:

Re: Psi genom III - genetyczny odcisk polca

Post autor: 1e2w3a » niedziela 05 sty 2020, 21:39

Polimorfizm sekwencji satelitarnych.

Polimorfizm to występowanie różnych odmian alleli (sekwencji nukleotydów) jakie mogą się znaleźć w danym locus. Czyli jest to mutacja – ale nie każda mutacja może być zaliczona do polimorfizmów. Jeżeli w danej populacji określony allel występuje z częstością większą niż 1 % to mamy do czynienia z polimorfizmem. Czyli polimorfizm to taka częściej występująca mutacja. Każdy polimorfizm jest mutacją ale nie każda mutacja jest poliformizmem.
Jeśli chodzi o mikrosatelity to są one mniej konserwatywne od sekwencji genowych i częściej podlegają zmianom. Ale to są specyficzne zmiany i dotyczą tylko różnej liczby powtórzeń danego motywu co przekłada się na długość takiego mikrosatelity. Tak więc jest to mutacja ilościowa a nie np. punktowa, delecja, inwersja, czy translokacja. Taki polimorfizm w obszarach poza genowych wpływa na pojawienie się różnic w genotypie między osobnikami w danej populacji. Ponieważ pies (podobnie jak człowiek i wiele innych zwierząt) jest organizmem diploidalnym (zawiera w swoim genomie podwójny zestaw chromosomów : jedna połowa pochodzi od matki a druga od ojca) to w danym locus mogą wystąpić różne długości sekwencji mikrosatelitarnych. Na chromosomie „matczynym” może (ale nie musi) być inna liczba powtórzeń motywu niż na chromosomie „ojcowskim”. To właśnie ten poliformizm jest wykorzystywany do ustalania profilu DNA. Oczywiście w danej populacji nie występuje jakaś nieskończona liczba polimorfizmów ale jeżeli jest ich na tyle dużo to pojawienie się drugiego osobnika z takim samym profilem DNA jest tak mało prawdopodobne, że wręcz graniczy z cudem. Jeżeli zaś w jakiejś populacji występuje mały poliformizm tych sekwencji to określenie pokrewieństwa jest niejednoznaczne. Czyli im większa pula mikrosatelitów dla danej populacji i im więcej miejsc na chromosomach (loci) w których mogą się znaleźć - tym lepiej dla badań, które wtedy dają wynik jednoznaczny i pewny. Powiększa się bowiem zbiór „genetycznych” linii papilarnych .
Sekwencje mikrosatelitarne podlegają dziedziczeniu. W procesie mejozy w którym powstają gamety dochodzi do replikacji, czyli skopiowania całego DNA , sekwencje mikrosatelitarne też ulegną podwojeniu. Do tworzącej się gamety w wyniku losowego przeciągnięcia może trafić bądź chromosom „matczyny” bądź „ojcowski” wraz s sekwencjami mikrosatelitarnymi.

W celu zilustrowania tego schematu dziedziczenia rozpatrzmy poniższy przykład. Znana jest pula sekwencji mikrosatelitarnych występujących w danej populacji i loci w których mogą być usytuowane. W naszym (teoretycznym ) przykładzie pula liczy 10 wersji mikrosatelitów. Są 3 loci w których mogą się znaleźć.

PULA
locus 1 : 7, 10, 12
locus 2 : 3 , 8 , 9
locus 3 : 5 , 7 , 11, 12

Te liczby : 3, 5, 7, 8, 10, 11, 12 niech obrazują liczbę powtórzeń. Im większa liczba tym dana sekwencja, przynależna do danego locus, jest dłuższa. I tak np. w locus 1 mogą wystąpić trzy wersje alleli mikrosatelitarnych o długości 7. lub 10. lub 12 powtórzeń. Zauważmy, że pewne liczby się powtarzają, dotyczy to 7 i 12. To znaczy, że niektóre wersje alleli w loci 1 i 3 mają taką samą liczbę powtórzeń ale to są zupełnie inne allele bo przynależą do różnych loci i ich motyw jest inny. Dwie powtórzone 7. w locus 1 u matki oznacza, że na chromosomie „matczynym” i „ojcowskim” w tym samym (homologicznym) regionie mikrosatelitarnym wystepuje ten sam allel.

MATKA
locus 1 : 7;7
locus 2 : 3;8
locus 3 : 5;7

OJCIEC
locus 1 : 10;12
locus 2 : 8;9
locus 3 : 11;12

Uwaga : średnikiem rozgraniczę allele odziedziczone po matce ( te na lewo od średnika) od alleli odziedziczonych po ojcu (na prawo od średnika).

Ich potomek może odziedziczyć następujące kombinacje alleli mikrosatelitarnych :
POTOMEK
locus 1 : 7;10 , 7;12
locus 2 : 3;8 , 3;9 , 8;8 , 8;9
locus 3 : 5;11 , 5;12 , 7;11 , 7;12

I tylko z takich układów alleli wybranych pośród tych możliwych do odziedziczenia mógłby się składać profil DNA potomka.

W następnym poście będzie o potwierdzeniu lub zaprzeczeniu ojcostwa.

CDN


SOKOŁÓWKA

Zapraszam na stronę o moich ogarach : http://www.mojeogary.ga

Awatar użytkownika
1e2w3a
Posty: 2294
Rejestracja: wtorek 28 wrz 2010, 21:07
Gadu-Gadu: 0
Lokalizacja: MIĘDZYBÓRZ / WROCŁAW, Dolny Śląsk
Kontakt:

Re: Psi genom III - genetyczny odcisk polca

Post autor: 1e2w3a » czwartek 09 sty 2020, 20:53

Potwierdzenie / zaprzeczenie ojcostwa

Ustalenie profilu DNA jest wykorzystywane do badania pokrewieństwa. Aby ustalić pokrewieństwo potrzebny jest profil nie tylko wybranego psa ale też innych wytypowanych psów aby następnie te profile móc porównać i potwierdzić lub wykluczyć pokrewieństwo. Jeżeli jest jakieś pokrewieństwo między naszym wybranym psem a psem wytypowanym – to część markerów mikrosatelitarnych naszego „wybrańca” powinna być tożsama z markerami wytypowanego psa. To jaka to część będzie zależeć od stopnia pokrewieństwa między nimi. Jeżeli takich markerów u wytypowanego psa jest zbyt mało to pokrewieństwo między nimi należy wykluczyć.
W przypadku potwierdzenia ojcostwa potrzebny będzie profil DNA szczeniaka oraz reproduktora. Jeżeli pojawią się już na początku wątpliwości co do ojcostwa reproduktora, można zrobić profile DNA innym psom, które podejrzewamy o jakiś związek z przyszłą matką. Również w przypadku podwójnego krycia suki konieczne będzie ustalenie profili DNA szczeniaków i reproduktorów, by
wiadomo było którego ojca ma dany szczeniak.
Jeżeli uważa się, że szczeniak pochodzi od danej matki i danego ojca to wszystkie części profilu DNA tego szczeniaka muszą zawierać części profilu matki i części profilu ojca (w każdym wyróżnionym mikrosatelitarnym locus musi być jeden allel STR od matki i jeden allel STR od ojca). Jeżeli choćby w jednym takim locus będzie odstępstwo od tego warunku to z bardzo dużym prawdopodobieństwem można wykluczyć ojcostwo (oczywiście zakładając, że wszystkie części profilu matki znajdują się w profilu szczeniaka).

Wróćmy do przykładu z poprzedniego postu. Jest pewna pula markerów STR (10 wariantów), i tylko 3 miejsca w genomie gdzie te markery mogą się znajdować (3 loci). Zobaczymy jak to może się przełożyć na potwierdzenie lub zaprzeczenie ojcostwa. Domniemamy, że ojcem potomka może być jeden z trzech osobników. W takim przypadku potrzebne będą profile potomka, potencjalnego ojca1, ojca2 i ojca3. Zakładamy, że co do matki nie ma wątpliwości. Niech jej profil będzie taki sam jak w poprzednim poście.

MATKA
locus 1 : 7;7
locus 2 : 3;8
locus 3 : 5;7

OJCIEC1
locus 1 : 10;12
locus 2 : 8;9
locus 3 : 7;12

OJCIEC2
locus 1 : 12;12
locus 2 : 9;3
locus 3 : 11;5

OJCIEC3
locus 1 : 10;12
locus 2 : 9;9
locus 3 : 5;12

POTOMEK
locus 1 : 7;12
locus 2 : 8;9
locus 3 : 5;5

Ojcem POTOMKA może być OJCIEC2 lub OJCIEC3, bowiem w każdym z trzech loci POTOMKA można znaleźć przynajmniej jedną wersję alleliczną przynależną do profili tych ojców. Te wersje zapisane są w profilu potomka po średniku. Druga wersja alleliczna pochodzi z profilu matki (to ta przed średnikiem). Przeanalizujmy dla przykładu locus 1 POTOMKA. I tak w tym locus POTOMEK odziedziczył po matce allel będący 7. krotnym powtórzeniem pewnego motywu, a od ojca – allel będący 12. krotnym powtórzeniem tego samego motywu. Jak widać te allele o krotności 12 można znaleźć w profilach obu wymienionych ojców. Podobna zgodność będzie w pozostałych loci.
Natomiast jak porównamy profile POTOMKA i OJCA1 to zauważymy, że w locus 1 POTOMEK i OJCIEC1 mają ten sam allel o krotności 12, w locus 2 u obojga występuje allel o krotności 9 ale w locus 3 u POTOMKA nie ma ani jednej wersji allelicznej pochodzącej od OJCA1. U POTOMKA jest allel o krotności 5, a u OJCA1 takiego allelu nie ma (za to jest allel o krotności 7 i allel o krotności12). Czyli ojcostwo OJCA1 należy wykluczyć.
Gdybyśmy poddali porównaniu profil POTOMKA i np. OJCA2 to wynik na ojcostwo wypadłby pozytywnie. Ale takie ojcostwo można by podważyć a to ze względu na niewielką liczbę loci dla markerów mikrosatelitarnych. Aby badanie było jednoznaczne to musi być prawdopodobieństwo sięgające 99,99%, że w danej populacji nie powtórzy się osobnik z tym samym profilem DNA (oczywiście poza bliźniakami jednojajowymi, które też mogą się pojawiać wśród psów). Jeżeli sekwencje STR cechuje duży polimorfizm, odpowiednio duża liczba przebadanych loci tym profil danego osobnika staje się bardziej indywidualny i niepowtarzalny i wręcz niemożliwy do podważenia. Jeżeli założymy, że w populacji występują tylko 4 formy danego markera to przy badaniu tylko jednego locus prawdopodobieństwo znalezienia osobnika o tym samym profilu (tym samym układzie markerów mikrosatelitarnych) wynosi 1/9. Jeżeli zwiększymy liczbę badanych markerów do 15 to prawdopodobieństwo wyniesie 1/275 bilionów.

W następnym poście będzie krótko o reakcji PCR (dzięki której możliwe jest ustalenie profilu DNA) i jeszcze jeden przykład na potwierdzenie/zaprzeczenie ojcostwa.
CDN


SOKOŁÓWKA

Zapraszam na stronę o moich ogarach : http://www.mojeogary.ga

Awatar użytkownika
1e2w3a
Posty: 2294
Rejestracja: wtorek 28 wrz 2010, 21:07
Gadu-Gadu: 0
Lokalizacja: MIĘDZYBÓRZ / WROCŁAW, Dolny Śląsk
Kontakt:

Re: Psi genom III - genetyczny odcisk palca

Post autor: 1e2w3a » wtorek 14 sty 2020, 19:29

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji PCR (polymerase chain reactiom).

To reakcja enzymatyczna pozwalająca na wielokrotne namnożenie (skopiowanie) specyficznych sekwencji DNA (dla profilu DNA będą to markery STR). Warunkiem jest znajomość sekwencji na obu końcach regionu który ma być kopiowany (są to tzw sekwencje flankujące, oskrzydlające).
Otrzymana w ten sposób namnożona ilość DNA jest poddawana dalszej analizie.
Składnikami tej reakcji są : matrycowy DNA (z sekwencjami przeznaczonymi do namnożenia), startery (otrzymane drogą syntezy chem. ,które rozpoznają sekwencje flankujące mikrosatelitów i „przyczepiają” się do nich), polimeraza DNA (enzym który kopiuje cząsteczkę DNA po uprzednim rozpoznaniu startera), nukleotydy (substraty dla polimerazy, to z nich tworzone są nowe nici DNA).
Reakcja przeprowadzana jest w cyklach w których odbywa się sterowanie temp. aby aby uzyskać określony rezultat (np. despiralizacja i ponowna spiralizacja podwójnej nici DNA, przyłączanie starterów do DNA, optymalizacja aktywności polimerazy).
Końcowym efektem są świecące prążki – uporządkowane wg wielkości markery (sekwencje) STR , które następnie poddaje się analizie w celu ustalenia profilu.
Aby nie dochodziło do podważania wyników reakcja PCR musi być przeprowadzona z zachowaniem należytej staranności, skrupulatności i rzetelności, przestrzegania ustalonych procedur, zabezpieczona przed dostaniem się zanieczyszczeń mogących wpłynąć na wynik reakcji, właściwym pobraniem próbki z DNA.
Tak więc dzięki tej reakcji można daną sekwencję (marker) STR „wydobyć” z DNA osobnika a następnie zbadać jej długość. Do „wydobywania” tych sekwencji stosuje się inne sekwencje (laboratoryjne markery), których liczba zależy od liczby regionów (loci) które będziemy przeszukiwać. W przypadku ustalania profilu DNA dla psów trzeba przeszukać co najmniej osiem loci (użyć 8 markerów) aby wynik nie budził wątpliwości. Ale znalazłam też laboratoria gdzie stosuje kilkanaście różnych markerów w celu ustalenia profilu (np. 19 a nawet 21). Te markery mają swoje oznaczenia składające się z ciągu liter i cyfr. Udało mi się znaleźć w internecie taką informację :
Do potwierdzenia pochodzenia stosowany jest zestaw 21 markerów DNA rekomendowany przez Międzynarodowe Towarzystwo Genetyki Zwierząt (ISAG) do kontroli pochodzenia – AHTk211, CXX279, REN169O18, INU055, REN54P11, INRA21, AHT137, AHT130, REN169D01, AHTh260, AHTk253, INU005, REN105L03, INU030, FH2848, AHT121, FH2054, REN162C04, AHTh171, REN247M23, REN64E19.
Jeden użyty marker jest w stanie „wydobyć” z określonego mikrosatelirarnego regionu chromosomu dwa odcinki różnej (lub takiej samej) długości z powtarzającym się motywem. Jeden z tych odcinków to allel (mikrosatelita) „ojcowski”, a drugi to allel (mikrosatelita) „matczyny”.
Ja wprawdzie nie jestem genetykiem, nie wiem jak wygląda taka praca w laboratorium – ale wydaje mi się, że ta reakcja PCR jest na tyle ważna, że nie sposób o niej nie wspomnieć.

Przykład :

Dysponujemy profilami DNA trzech szczeniaków, ich matki oraz reproduktora (załącznik poniżej), którego ojcostwo chcemy potwierdzić lub wykluczyć. Profil DNA suki jest na czerwono, profil reproduktora na niebiesko, zaś wszystkie niezgodności w profilach szczeniaków są „wytłuszczone” na czarno.
Markery : M1, M2, ….., M9 to sekwencje które w 9. miejscach na różnych chromosomach mogą rozpoznać występujące tam dwie sekwencje STR .
Nie wiem w jakich jednostkach podaje się długości tych sekwencji ale przypuszczam, że mogą być to jednostki pz (par zasad, czyli liczba wszystkich nukleotydów tworzących dany ciąg sekwencji).
Z analizy tych liczb zestawionych w formie tabeli i przyporządkowanych suce, reproduktorowi i szczeniakom można wywnioskować, że :

–- reproduktora jako ojca dla szczeniaka1 i szczeniaka2 należy wykluczyć. W przebadanych 9. miejscach aż w 6. nie ma zgodności między allelami które szczeniak odziedziczył od ojca a allelami które występują u reproduktora.

–- w przypadku szczeniaka3 reproduktora można by uznać za ojca. Tylko bowiem w jednym miejscu (odpowiadającym markerowi M2) brak jest tej zgodności. Takie niewielkie odstępstwo można przypisać przypadkowej mutacji jaka zaszła u reproduktora w tym miejscu. Obecnie już poznano w genomie psa wiele poliformizmów mikrosatelitarnych co bardzo bardzo uwiarygadnia profile DNA. Przyjmuje się, że w przypadku użycia 19 markerów możliwe jest odstępstwo tylko w dwóch miejscach. Jeżeli jest w trzech lub więcej to ojcostwo należy wykluczyć. W powyższym przypadku jest jedno odstępstwo przy użytych 9. markerach i dlatego napisałam, że reproduktora można by uznać za ojca szczeniaka3, ale w żadnym wypadku za ojca szczeniaka1 i szczeniaka2.

--wszystkie trzy szczeniaki odziedziczyły po matce jej allele i tu nie ma żadnych niezgodności.

Na stronie https://pl.laboklin.info/wp-content/upl ... 3-2008.pdf. można znaleźć podobny przykład. Są tam też podstawowe informacje na temat badania pokrewieństwa między psami, sporządzania profilu DNA i opis przypadku w którym to podważone zostało ojcostwo reproduktora. Mój przykład był wzorowany na przykładzie z tej strony.

I jeszcze podam link do strony https://wz.izoo.krakow.pl/files/WZ_2015_4_art17.pdf , na której też można znaleźć jeszcze inny przykład ale profile DNA są podane w formie wykresu.
Załączniki
Bez nazwy.png
Bez nazwy.png (27.41 KiB) Przejrzano 111 razy


SOKOŁÓWKA

Zapraszam na stronę o moich ogarach : http://www.mojeogary.ga

ODPOWIEDZ